制造商的博客系列

为什么这么多克隆文档是错误的?

2022年2月24日
By 比约恩·约翰逊

相当多的生命科学研究依赖于重组DNA分子的构建或分析. 这些分子的确切序列对于它们所参与的科学工作的可重复性至关重要. 每次发布都会伴随对克隆策略的特别描述. 不幸的是, 大多数已发表的克隆策略要么不完整,要么模棱两可, 有些人显然错了. 手动执行克隆策略是一个艰难的过程, 这可能是为什么这么多此类错误通过了同行评审程序的原因. Pydna是Python的扩展,用于克隆策略的紧凑表达. 具有基本Python知识的用户可以阅读jupiter Notebook中的Pydna, 由于叙事形式类似于传统的自由形式描述. 这些克隆策略很容易验证,只需重新执行笔记本即可. 另一个好处是使用自动集成服务进行自动验证,例如 GitHub的行为.

这个问题

代谢工程 生命科学领域是否经常涉及到代谢途径的调节,以产生所谓的代谢产物 细胞工厂 生物技术上有趣的分子. 细胞工厂被认为将在向绿色经济的转型中发挥未来的作用. 在我自己的实验室, 天博app下载试图通过向面包酵母中插入新的基因来生产辣椒素分子中的脂肪酸部分,它给辣椒带来热量, 从本质上说,这种有机体曾经在家里做面包.

图1:E. 大肠杆菌(绿色)转移到贝克酵母细胞(蓝色). 最终目标是生产辣椒素中的脂肪酸(红框). 图的 克劳迪娅BarataMinho大学.

天博app下载需要通过将较小的DNA分子结合成较大的DNA分子来确保新的DNA分子在细胞内得到稳定的维持和发挥作用(DNA重组)根据计划,通常被称为 克隆策略.

那么为什么要用这个颇具挑衅性的博客标题呢? 事实证明,许多涉及重组DNA的学术出版物并不包含完整的DNA, 用于实验的DNA结构的明确克隆策略. 克隆策略有时是通用的, 如“X”基因被克隆到质粒Y中,从而得到质粒Z.” (A 质粒 是一种可以自我复制的小环状DNA片段 克隆 在这里意味着简单地将DNA分子连接在一起.这些信息不足以重建Z质粒, 使得质粒Z的研究不可复制. 未能记录克隆策略的精确努力是不幸的,也是不必要的, 因为它们由一系列简单的单元操作串联在一起,而结果几乎总是确定的.

克隆策略描述

手工规划克隆项目, 指击式DNA编辑器与从数据库或DNA测序实验中获得的序列文件一起使用, 是很常见的. 这些数据文件,序列加入号,PCR引物序列等. 为了重新创建最终的构造序列,需要对所执行的操作进行详细的描述吗 体外 or in-silico. 即使提供了这些信息, 除非手动重新创建每个步骤,否则不能保证它是正确和完整的. 这可能并不容易, 然而, 因为对于应该包含哪些信息或如何描述克隆策略,目前还没有广泛采用的标准.

可执行的克隆策略

克隆策略可以使用pydna包在Python中正式表示. Pydna可以处理最常见的亚克隆技术(i.e. 将DNA分子拼接在一起的技术). jupiter Notebook支持线性叙述格式,这种格式通常已经用于描述克隆实验.

皮德纳在实践中

在酵母中合成辣椒素脂肪酸的几种基因修饰中,有一种是从细菌中表达的脂肪酸合成酶基因AcpH(酰基载体蛋白磷酸二酯酶) E. 杆菌. 在一个叫做pYPKa的质粒中克隆这个基因将作为如何使用pydna的一个简单的例子.

图2:用限制性内切酶(pacman)切pYPka质粒. 大肠杆菌AcpH基因. 大肠杆菌通过PCR扩增. 最后两个DNA分子通过连接结合在一起.

利用限制性内切酶克隆构建质粒

第一步是从pydna导入一些需要的功能.

pYPKa 质粒是从本地文本文件中读取的. 这个DNA分子是圆形的.

的限制性内切酶 AjiI 从Python包中导入Biopython. (A 限制性内切酶 分子剪刀能以一种可预测的方式切断DNA链吗.)

使用限制性内切酶将圆形质粒线性化,限制性内切酶将质粒切割到一个独特的位置.

访问 基因库 需要什么才能下载AcpH基因. 国家生物技术信息中心(NCBI)提供了一种名为“E-utilities,可以从Python中访问. 在执行此脚本之前,请更改下面的电子邮件地址,因为在使用电子实用程序时,您总是应该提供一个电子邮件地址.

AcpH基因从下面的基因库下载.

下载的基因可以在这里查看: NC_000913 424337 - 424918. 天博app下载通过将DNA序列打印成字符串来检查基因:

该基因从源DNA(通常称为模板DNA)通过使用 Polymerase C海恩 R晚间(PCR). 相对于模板DNA,一个相对短的、特定的DNA片段被大量复制. (PCR也被用于检测像COVID-19这样的传染病.)以下2条PCR引物(868 & 867)用于PCR扩增AcpH基因. PCR引物是用来指导PCR基因复制过程的单链DNA短片段.

该基因通过PCR合成,采用两种PCR引物:

天博app下载可以想象引物是如何位于AcpH基因的两端的,就像这样:

最后的载体由两个线性DNA分子连接在一起:

天博app下载只需将两个线性DNA分子加在一起,然后告诉pydna天博app下载想要一个环状序列,使用环状方法. 最后,天博app下载可以使用write方法将质粒写入文件.

上面完整的例子可以在木星笔记本上找到 在这里.

同源重组质粒构建

天博app下载在前面的例子中制造的质粒不足以使基因活跃. 这个基因通常需要一个 启动子 和一个 《天博体育app下载》 为了 抄写. 启动子和终止子是DNA的起始和终止片段 转录,生成基因的RNA拷贝(mRNA).

同源重组和吉布森组装技术通常用于组装较大的, 更复杂的重组DNA分子. 这些技术需要在DNA末端有一段相同的DNA序列. Pydna实现了一种完全依赖于分子DNA序列的DNA组装算法. 在下面的例子中, 天博app下载用pydna模拟同源重组,为天博app下载在前面的例子中克隆的基因制作表达质粒.

图3:用限制性内切酶(pacman)切pYPkpw质粒. 通过PCR得到启动子、AcpH基因和终止子. 四个线性DNA分子通过共享的DNA序列重组在一起,形成一个新的环状分子.

天博app下载从本地文件中读取DNA序列.

pYPKa_Z_RPL17A和pYPKa_E_RPL16B质粒与前面例子中构建的质粒相似, 而是携带一个启动子和一个终止子, 分别. 天博app下载用三对PCR引物合成三种PCR产物:

质粒载体经限制性内切酶消化线性化 EcoRV.

装配算法检查参数中的DNA序列, 丢弃小于某一限制的序列.

程序集类有两个方法可供选择, assemble_circular和assemble_linear, 取决于程序集的目标. 天博app下载对环形装配感兴趣.

天博app下载得到了pYPK0_RPL17A_EcacpH_RPL16B载体的两个循环产物. 这是因为这两个分子互为相反的补体.

天博app下载可以看到四个线性DNA分子是如何聚集在一个新的圆形质粒中的. 下图中的数字是共享相同序列的长度.

为简洁起见,上面的代码示例省略了一些基本步骤. 提供了具有完整的同源重组示例的木星笔记本 在这里.

结论

目前采用pydna的一个障碍是一些生物学家仍然持有与“编写代码”有关的稍微消极的观点. 然而, 编程可能会成为未来生物学家工具箱中不可分割的一部分,因为在这个领域产生的数据量会不断增加. Pydna和类似的工具可以帮助在生命科学中争取可再生性.

确认

这项工作由Fundação para a Ciência e葡萄牙技术协会(FCT)通过FatVal PTDC/EAM-AMB/032506/2017项目支持,该项目由国家基金通过FCT I资助.P. 并由ERDF通过COMPETE2020 -项目运营竞争Internacionalizacão (POCI). CBMA得到了战略计划UIDB/04050/2020的支持,该计划由国家基金通过第一期FCT提供资金.P.

关于作者

比约恩·约翰逊 是布拉加的米尼奥大学生物系的助理教授, 葡萄牙, 带领一个小研究小组教生物学. 主要研究方向为酵母生理与代谢工程, 他的团队正试图拓宽面包酵母的新陈代谢,包括有趣的新产品和基质. 在生物学之外,Björn对生物信息学和开放可再生科学感兴趣. 他也是一个开源软件爱好者,从2007年开始在桌面上使用Linux.

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